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Isomin: una nuova proteina citoplasmatica filamento intermedio da una specie di artropodi astratto sfondo L'espressione di filamenti intermedi (IFS) è una caratteristica segno distintivo di cellule metazoi. FI svolgono un ruolo centrale nell'ambito dell'organizzazione delle cellule e la funzione, agendo principalmente come elementi di stress che assorbono strutturali. È sempre più evidente che suggeriscono che questi elementi del citoscheletro sono coinvolti anche nel processo di integrazione delle reti di segnalazione. Secondo le loro funzioni fondamentali, FI mostrano una diffusa espressione filogenetica, da semplici animali diblastic fino ai mammiferi, e le loro proteine costituenti condividono la stessa organizzazione molecolare in tutte le specie finora analizzati. Artropodi rappresentano una importante eccezione in questo scenario. Solo lamine, il nucleare, se le proteine, sono stati finora individuati negli organismi modello analizzati; Su questa base, si è ritenuto che gli artropodi non esprimono FI citoplasmatici. risultati Qui, si segnala la prima prova per l'espressione di una proteina citoplasmatica IF in un artropode - la hexapod basale Isotomurus maculatus. Questa nuova proteina, abbiamo chiamato isomin, è un componente del intestinale web terminale e azioni IFS tipiche proprietà biochimiche, le caratteristiche molecolari e la capacità di riassemblaggio. Le analisi della sequenza indica che isomin è in gran parte legata alla Intermedio Filament proteina C (IFC) sottofamiglia di Caenorhabditis elegans se le proteine, che sono costituenti molecolari del nematode intestinale web terminale. Questo risultato è coerente con, e fornisce ulteriore supporto alla, le più recenti vedute filogenetici di artropodi antenati. È interessante notare che il dominio coil 1a isomin sembra essere influenzata da una deriva molecolare sostanziale e solo la parte aminoterminale di questo dominio, contenente il cosiddetto motivo iniziazione elica, è stato conservato. Conclusioni I nostri risultati impostare una nuova base per l'analisi di se l'evoluzione delle proteine durante la filogenesi degli artropodi. Alla luce di queste nuove informazioni, l'affermazione che il phylum artropodi manca FI citoplasmatici non è più sostenibile. sfondo I filamenti intermedi (IFS) sono i principali elementi del citoscheletro delle cellule metazoi. Essi formano un sistema integrato che si estende dalla membrana cellulare al nucleo e, ancorando alle giunzioni intercellulari, contribuiscono a coordinare cellule individuali in tessuti (recensiti [1 2]). Le proprietà meccaniche dei FI sono cruciali per il mantenimento della forma delle cellule e l'integrità del tessuto, sia nell'organismo adulto e durante lo sviluppo embrionale e la differenziazione dei tessuti specifici. Essendo elementi molto forti ed estensibili, forniscono la cella con proprietà meccaniche uniche e agiscono come componenti citoscheletriche stress assorbimento. Recentemente, è stato proposto che i FI agiscono come impalcatura per la trasduzione di non solo perturbazioni meccaniche, ma anche di altri tipi di segnali dall'esterno verso tutti i compartimenti interni della cellula e, da questa, l'idea di FI come "piattaforme regolamentazione 'implicato nella regolazione di vie di segnalazione chiave è emerso [2]. SE proteine sono codificate da una grande famiglia di geni, che comprende sia le lamine nucleari e citoplasmatici IF proteine; la loro espressione è evolutivamente-regolata e tessuto-specifica [1]. Coerentemente con il ruolo centrale di FI in funzione delle cellule, hanno dimostrato mutazioni nei geni che codificano FI per causare o predisporre, per più di 30 diverse malattie umane [3]. Tutti i membri della famiglia, se condividono una tipica organizzazione molecolare tripartita che è stato conservato nel corso dell'evoluzione dei metazoi. È costituita da un dominio α-elica centrale assemblaggio competente con capacità coiled-coil formando - il cosiddetto dominio rod - e di amminoacidi e carbossiterminale domini, denominati rispettivamente la testa e il dominio di coda, che sono di lunghezza variabile, sequenza e le proprietà [4]. Il dominio asta è diviso in sottodomini (bobine 1a, 1b, 2a e 2b) di linker non elicoidali brevi (L1, L12, L2). La lunghezza dello stelo e dei suoi diversi sottodomini è definita e conservata tra le specie. lamine nucleari sono caratterizzati da un dominio lunga barra, a causa di un extra 42 residui nel loro bobina 1b sottodominio [4. 5]. Per proteine citoplasmatiche SE, sondaggi filogenetiche hanno evidenziato la presenza di due prototipi molecolari, che segregano in base alle linee filogenetiche: la L-tipo, che condivide con lamine un dominio asta più lunga e si esprime in protostome phyla; e il S-tipo, dotato di una rod dominio più corto, che si ritiene essere derivata dalla L-type da un evento cancellazione e, fino ad ora, è stato rilevato solo nei tre deuterostomi chordate phyla [6]. Su questa base, è stato ipotizzato che FI citoplasmatici sorsero presto in evoluzione da un gene mutato lamina [7]. Duplicazioni di geni se seguita dalla diversificazione e la specializzazione dei nuovi geni si sono verificati durante l'evoluzione del più phyla. La complessità del citoplasmatica IF repertorio proteina espressa in diversi phyla metazoi così varia, raggiungendo il suo massimo nei vertebrati che esprimono fino a 70 proteine appartenenti a sei distinti se sottofamiglie [8]. In un tale scenario, artropodi, il più grande phylum metazoi, sono una importante eccezione. Infatti, sia la microscopia elettronica [9] e gli studi di clonazione molecolare [6. 10] sono stati in grado di rilevare qualsiasi citoplasmatica della proteina IF in questi organismi, anche se lo fanno esprimere una nucleare, se il sistema realizzato in lamine autentiche. Sono stati proposti altri componenti citoscheletriche aver assunto, negli artropodi, le funzioni meccaniche che di solito sono riprodotti dai FI citoplasmatici in altri organismi (discusse in [11]). Ad esempio, le cellule epiteliali delle ali sono stabilizzati negli insetti da una serie citoscheletro costituito da fasci paralleli di microtubuli 15-protofilament e filamenti di actina [12]. Tuttavia, l'assenza di FI citoplasmatici in questo phylum è ancora sconcertante. Nelle specie collemboli appartenenti ai generi Isotomurus e Isotoma l'organizzazione dell'epitelio midgut è insolito per la presenza di un particolare, filamentosa web [13 14] che è stata preliminarmente dimostrato non consiste di actina, contrariamente a quanto visto in vertebrato intestinale web terminale [15]. Descriviamo l'identificazione e la caratterizzazione molecolare della proteina formante tale matrice citoscheletrica particolare. Questa proteina, che abbiamo chiamato isomin, azioni IFS citoplasmatici caratteristiche tipiche molecolari e nelle proprietà di assemblaggio vitro. Così, i nostri risultati forniscono la prima prova di un citoplasmatica IF proteina espressa in una specie di artropodi. risultati Un web terminale peculiare Isotomurus midgut dell'epitelio specie collemboli appartenenti al genere Isotomurus espresso, nel loro epitelio midgut, un web-terminale peculiare costituito da uno strato denso di cintura di filamenti strettamente intrecciate di circa 8-10 nm di diametro, che attraversa il citoplasma apicale e contatti lateralmente la membrana a livello svincolo septate dove filamenti aderiscano e rafforzare la faccia citoplasmatica della giunzione (Figura 1a e 1b). Questo array citoscheletro sembra fungere da struttura di ancoraggio per i fasci di microfilamenti discendenti da microvilli e segrega citoplasma in un apicale ed una regione basale che sono strutturalmente distinti, quest'ultimo contenente la maggior parte degli organelli cellulari. Il web non è continua ma mostra diverse finestrature che appaiono in qualche modo essere rinforzato in corrispondenza dei bordi (Figura 1A e 1B). La microscopia elettronica e analisi elettroforetica di Isotomurus terminale intestinale web. (A, b) Il web terminale (tw) è una struttura discontinua formata da filamenti che contattano la giunzione septate (sj). Microfilamenti (MF) discendente da microvilli inserire sul terminale web. Bar = 1 micron. (C) La microscopia elettronica analisi citoscheletriche preparazioni midgut Triton-resistenti ottenuta come descritto in Materiali e metodi: il terminale web non è influenzato dal trattamento con detergente e soluzioni ad elevata forza ionica. Bar = 200 nm. (D) l'analisi elettroforetica su gel di SDS-poliacrilammide 8% della frazione detergente-insolubili da Isotomurus dell'intestino: una banda proteica maggiore (I) è presente, che migra immediatamente sotto actina (A). Abbiamo preliminarmente segnalato che il web non consiste di actina, poiché non è decorato da anticorpi specifici oa frammenti meromyosin pesanti e non smontare dopo trattamento con citocalasina B [15]. Inoltre, è molto resistente alla estrazione con / soluzioni detergenti contenenti alte di sale, che solubilizzano componenti più citoplasmatici (figura 1c). Il componente principale della frazione residua è una proteina con un peso molecolare apparente di circa 40 kDa che migra immediatamente sotto actina dopo SDS-page (Figura 1d). L'organizzazione ultrastrutturale della regione epiteliale apicale nel midgut di Isotomurus sp. è fortemente ricorda il web terminal descritto nell'intestino di alcune specie di nematodi [16]. In Caenorhabditis elegans. il web contiene un gruppo di IF proteine [17]. La possibilità che il Isotomurus filamentosa web è montato anche da proteine IF-correlati è, infatti, suggerito dalle sue proprietà di insolubilità. Su questa base, e al fine di confermare questa ipotesi, abbiamo deciso di caratterizzare la proteina 40 kDa (che abbiamo chiamato isomin). a livello molecolare e per valutare la sua relazione con il web intestinale. Sequenziamento e analisi molecolare delle proteine isomin Isomin è stato il primo enzimaticamente digerito e le principali peptidi trittico sono stati analizzati mediante spettrometria di massa. Questa analisi ha fornito una serie di brevi sequenze di aminoacidi che non corrispondono con qualsiasi proteina di proteine o manifestato sequence tags database (EST). Tuttavia, alcuni di questi frammenti contengono un tratto definito di aminoacidi che hanno permesso la progettazione di primer senso e antisenso degenerati (Ulteriori file 1. S1 Table). Tra le combinazioni di primer che abbiamo testato, solo uno (B2 / D1) ha avuto successo. Una serie di reazione inversa transcriptasi catena della polimerasi (RT-PCR) esperimenti comportato l'amplificazione di un frammento di 360 bp, che è stato clonato e sequenziato su entrambi i filamenti. La sequenza di amminoacidi dedotta corrispondente (120aa) contiene alcune delle sequenze aminoacidiche parziali ottenuti mediante spettrometria di massa, confermando la specificità della sequenza amplificata (File Ulteriori 2. Figura S1). La sequenza isomin completo è stato successivamente ottenuto da una rapida amplificazione 5'-3 'di DNA complementari estremità (RACE) utilizzando primer specifici disegnati sulla sequenza di 360 bp. Il DNA complementare integrale è 1570 bp: contiene un 1236 bp open reading frame corrispondente ad un dedotta sequenza aminoacidica di 411 residui, con una massa molecolare prevista di 48.036 Da e punto isoelettrico teorica di 6,65. La cornice di lettura aperta è fiancheggiato da 5 'e 3' non tradotte regioni di 72 bp e 262 bp, rispettivamente, con un segnale di poliadenilazione trova a 15 bp a monte della coda poliA (File Ulteriori 2. Figura S1). Una ricerca BLASTP per isomin omologhi provocato i 10 migliori punteggi riportati nella Tabella 1. Tra questi, otto sequenze proteiche sono dedotti dal genoma di diverse specie Drosophila e sono annotati in FlyBase come potenziali membri della famiglia di proteine Pfam filamenti intermedi: il presenza del segnale di localizzazione nucleare suggerisce che queste proteine sono lamine. I restanti due sequenze sono CASO proteine da Danio rerio e intestinalis Ciona. La percentuale osservata di somiglianza tra le proteine e isomin (24% -25% di identità, il 40% -43% positivi) individuati è nell'intervallo di solito si trova tra IF proteine, che conservano principalmente principi sequenza piuttosto che sequenze reali. BLASTP migliori 10 allineamenti. * Tutti i geni di Drosophila sono classificati per Pfam come proteine dei filamenti intermedi e sono omologhi di sequenze Lamin. † Questo gene è stato caratterizzato come citocheratina E7. Secondo i risultati BLAST, una secondaria analisi della struttura previsione indica che isomin possiede una organizzazione molecolare somiglianti la tipica struttura tripartita IF proteine, con la testa non elicoidale ed domini coda comprende un'asta coiled coil centrale che è, a sua volta, suddivisi in sottodomini. a Figura 2 documenti tale somiglianza allineando sequenza isomin e l'organizzazione dominio previsto con quelli esposti da Drosophila lamin C e da una serie di proteine rappresentante protostome FI citoplasmatici (vedi anche File Ulteriori 3. Figura S2 per ripetere heptad lungo tre spirale domini coil) L'allineamento della sequenza isomin con altri filamenti intermedi (IFS) rivela che le azioni isomin l'IF organizzazione molecolare tripartita. Sequenze riportati in figura sono rappresentanti di protostome FI citoplasmatici e lamine. Essi includono: due elegans proteine Caenorhabditis, IFC-1 [Swiss-Prot: O45168] e IFA-1 [Swiss-Prot: P90901]; il non-neuronale IF proteina dal aspersa molluschi Helix (IFEA, [Swiss-Prot: P22488]); la proteina IF dal anellide terrestris Lumbricus (Lumte, [Swiss-Prot: Q25421]), e Lamin DM0 da Drosophila melanogaster [Swiss-Prot: P08928]. Previsti segmenti di bobina a spirale che formano il dominio asta centrale sono di colore grigio. Il dominio asta è delimitato dalle conservati elica di iniziazione e di terminazione elica motivi; nella figura, i residui di tali sequenze di firma che sono condivisi da entrambi isomin e almeno uno degli altri IF sequenze sono evidenziate in rosso. I diversi sottodomini bobina a spirale all'interno dell'asta sono indicati da linee orizzontali. La regione isomin ancora dotato di capacità di spire arrotolato che contiene la maggior parte del motivo elica apertura e in parte coincide con l'inizio della bobina 1a in altri FI è inscatolato in rosso. La discontinuità in isomin bobina 2 che si verifica in corrispondenza della regione balbuzie di altre FI è segnato da una freccia. Nella sequenza Lamin, il motivo firma nucleare e la scatola CAAX terminal sono evidenziate in giallo e in verde, rispettivamente; il dominio di omologia lamina, che si verificano in tutte le sequenze riportate in figura tranne isomin e SFI-1, è inscatolato in grigio. Simboli sottostanti l'allineamento di sequenze indicano amminoacidi che ad una determinata posizione sono identici (*), fortemente simili (:) o debolmente simili (.). Come in tutti IF proteine, il dominio stelo isomin è delimitato da sequenze aminoacidiche conservate, i cosiddetti elica iniziazione e terminazione elica motivi [4] ed è diviso in tre distinte sottodomini coiled-coil da segmenti linker non elicoidali brevi (Figura 2 ). La sequenza consenso all'inizio dell'asta isomin mostra la sequenza di LNXR assolutamente conservati. Entro il motivo terminazione elica, la sequenza consenso della cosiddetta epitopo IFA (YRKLLEGEE) sembra essere scarsamente conservata. Tuttavia, la reattività con l'IFA (filamento antigene intermedio) anticorpo monoclonale è molto meno conservata tra phyla di invertebrati di quanto lo sia nei vertebrati [9. 18] e il verificarsi di IF è stata segnalata proteine che non contengono la sequenza di IFA canonica [19 ]. A parte molto brevi variazioni, isomin bobina 1b e la bobina 2 mostra la lunghezza conservata osservato in altre IF proteine. In particolare, la bobina 1b mostra il prototipo più tipico di lamine e protostome FI citoplasmatici [6]. Come in altre invertebrato IF proteine (per esempio [20]), la bobina 2 è un dominio coiled coil continuo, che non è previsto per essere interrotto da una regione linker non elicoidale in due sottodomini generalmente indicati come bobina 2a e la bobina 2b il consenso se la struttura. Tuttavia, i dati cristallografici hanno recentemente indicato una struttura continua serpentina a spirale per questo dominio in vimentin vertebrati [21]. In tutti i FI, una caratteristica obbligatoria è la presenza di una balbuzie - una discontinuità nel modello di ripetizione heptad che è equivalente a un inserimento di quattro residui supplementari alla fine di un heptad. La posizione della balbuzie è abbastanza conservata, indicativo del suo ruolo fondamentale nell'assemblaggio filamento [4]. In isomin, bobina 2 presenta anche in questa posizione una discontinuità nella graduale heptade. Va notato che tale discontinuità corrisponde all'inserimento di due (f, g) - anziché quattro (d, e, f, g) - residui supplementari (figura 2; File Ulteriori 3. Figura S2). È interessante notare che l'allineamento di isomin con altre IF proteine rivela un intervallo di due residui nella proteina proprio in questo sito (Figura 2). La stessa funzione è presente nella proteina CFI-2 da C. elegans [20] anche. Così, le azioni isomin l'organizzazione del consenso della bobina 1b e la bobina 2 segmenti di proteine IF, ma, al contrario, la bobina 1a mostra caratteristiche peculiari. Questa regione può essere facilmente identificato dal verificarsi del motivo elica iniziazione. Tuttavia, la successiva sequenza aminoacidica è profondamente alterato, la ripetizione heptade sottostante la struttura coiled-coil viene persa e solo una capacità spire coiled residuo è previsto a residui 15-33, che contengono il motivo elica iniziazione conservata (figura 2; aggiuntive file 3. Figura S2). Una breve sequenza ricca di residui di glicina e serina segue il motivo conservato, formando una regione di elevata flessibilità predetto (dati non mostrati). Questa è una caratteristica strutturale che, nella maggior parte se proteine, caratterizza il distanziale L1 e che è cruciale per il corretto assemblaggio IF [4]. Oltre alle interazioni idrofobiche che coinvolgono i residui apolari delle ripetizioni heptad, il corretto montaggio dei FI è specificato e stabilizzato dalla formazione di due ponti salini intra e interchain derivanti dalla disposizione regolare dei residui di carica opposta [4]. Come altre proteine IF, isomin contiene un'alta percentuale di residui carichi. La distribuzione lineare osservata di residui acidi e basici all'interno della bobina e la bobina 1b 2 potrebbe consentire la formazione di vari stabilizzanti interazioni ioniche. Sia 1b bobina e la bobina 2 sono segmenti di base, con un punto isoelettrico di, rispettivamente, 8,78 e 9,39. Questa è una caratteristica del tutto insolito tra SE proteine che, più comunemente, possiedono segmenti avvolto a spirale acide. domini coiled coil di base, tuttavia, si verificano anche in alcune IF proteine da C. elegans (coil 1a della proteina IFA-3, coil 1b in IFD-1 e in IFD-2). Nessun rapporto sequenza ovvia è evidente con altro se le proteine lungo la testa isomin e le regioni di coda (Figura 2). Sia la testa e la coda sono brevi segmenti acide. Il dominio coda manca dei motivi caratteristici delle lamine nucleari (il segnale di localizzazione nucleare e la casella CAAX C-terminale) confermando così che isomin è un citoplasmatica della proteina IF. Essa mostra un tratto interna peculiare arginina e prolina (residui 371-376) e un elevato contenuto di glicina (20,4%) e serina (18,5%) alternate. Quest'ultima caratteristica si riferisce al dominio coda isomin per l'insolita coda di C. elegans IFC-1 e IFC-2 proteine [20]. Analogamente, la coda isomin manca il dominio lamina-omologia che è presente nel dominio coda più protostome IF proteine tranne qualche proteine, tra i quali C. elegans CFI-1 e IFC-2 proteine [6. 20]. SE proteine possono subire molteplici modificazioni post-. In particolare, la fosforilazione è di fondamentale importanza per il controllo della dinamica e della funzione [22] IF. In vivo . questa modificazione post-traslazionale è modulata da molti chinasi e siti fosforilati sono raggruppati nella testa accessibili e / o domini coda, probabilmente a causa di un accesso limitato chinasi lungo il rod dominio coiled coil [22]. Come altri FI, isomin contiene diversi siti che si prevede di essere specificamente phosphorylable da diverse chinasi (File aggiuntive 4. Figura S3); questi sono più abbondanti nel dominio di coda (14,8% del dominio dei contenuti amminoacido) rispetto al tondino (6,4%) o nel dominio testa molto breve, che contiene un solo predetto residui treonina phosphorylable. Due siti sumoylation sono anche previsti a Lys 308 e Lys 347 (Ulteriori file 4. figura S3). Questa modifica di proteine - che è stato segnalato di recente a verificarsi anche in filamenti intermedi citoplasmatici espressi nelle strutture emidesmosoma simili di C. elegans dell'epidermide - è stata implicata nella regolazione della IF di montaggio, che colpisce il tasso di cambio tra il solubile e la polimerizzato IF frazione [23]. Isomin è una vera e propria componente del terminale web Isotomurus Per confermare che isomin è un vero componente del terminale Web Isotomurus, anticorpi policlonali specifici sono state sollevate contro il frammento proteico ricombinante 120 aa, ottenuto mediante clonazione del bp 360 prodotto di amplificazione (File Ulteriori 2. Figura S1): la specificità gli anticorpi purificati per affinità è mostrato in figura 3a. Esperimenti di immunofluorescenza su sezioni Isotomurus corpo intero rivelato una forte specificità della colorazione per l'epitelio midgut, poiché nessun altro tessuto reagito (dati non mostrati). Solo la regione apicale dell'epitelio midgut è stato fortemente macchiato (Figura 3b). Sezioni tangenziali alla superficie epiteliale mostrato una colorazione reticolato all'interno della cellula, che è compatibile con la presenza di una rete subapicale di filamenti, e un rinforzo del segnale fluorescente lungo i bordi delle celle in cui i filamenti del web aderiscano e corrono lungo la intercellulare giunzioni (figura 3c). Isomin è un costituente di Isotomurus terminale web. (A) Specificità degli anticorpi policlonali anti-isomin: (1) colorazione Coomassie-blue; (2) immunocolorazione. A = actina; I = isomin. Elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide 8%. (B, c) immunofluorescenza colorazione di sezioni di intestino in paraffina. Bar = 20 micron. (D) Immunoelectron microscopia localizzazione isomin al terminale web. Bar = 200 nm. La localizzazione di isomin da esperimenti di microscopia immunoelettronica inequivocabilmente stabilito che questa proteina è una componente specifica del terminale dell'intestino medio web Isotomurus. etichettatura L'oro è stato localizzato esclusivamente sul web filamentosa e non altri componenti cellulari sono stati etichettati dagli anticorpi anti-isomin (figura 3d). Isomin è in grado di formare filamenti in vitro Una caratteristica segno distintivo di proteine IF è la loro capacità di renature dopo solubilizzazione dal trattamento urea e di sottoporsi a un processo di ri-assemblaggio spontanea in condizioni adeguate. Così, abbiamo preliminarmente testato la capacità di isomin ricombinante per assemblare in vitro in filamenti, utilizzando le condizioni ri-assemblaggio standard descritti per gli altri SE proteine [24]. A seguito di questo protocollo, abbiamo osservato la formazione di filamenti morfologicamente distinte (figura 4a); analisi elettroforetica parallelo li mostrò essenzialmente costituito il 40 kDa isomin banda (Figura 4b). filamenti più ricostituiti erano circa 9-12 nm di diametro, ma alcuni filamenti non tessuti sono verificate anche, rivelando la presenza di più sottili, 2-4 protofilamenti nm (vedi punte di freccia in figura 4a. riquadro). La formazione in vitro in-di tali filamenti 'sciolto' potrebbe derivare da condizioni non ottimali di riassemblaggio. Il requisito per le condizioni di riassemblaggio peculiari potrebbe essere correlato alla particolare struttura della molecola isomin, che è caratterizzata da un dominio testa estremamente breve e da un segmento serpentina 1a modificato. Inoltre, non sappiamo se, in vivo. forme isomin homopolimers o è, invece, parte di un sistema di heteropolimeric IF, che richiede un partner per assemblare correttamente nel filamento stabile. Isomin in vitro riassemblaggio. (A) colorazione negativa in vitro-rimontata isomin filamento. Bar = 200 nm. L'inserto mostra a un maggiore ingrandimento di due filamenti fissati male, rivelando protofilamenti sottili (frecce); bar = 100 nm. (B) l'analisi elettroforetica su un gel di 12% SDS-poliacrilammide del sedimentata (P) e supernatante (S) frazione dopo centrifugazione in vitro rimontata isomin filamenti. La migrazione delle proteine riferimento peso molecolare è indicato a destra. Anche se ulteriori studi sono necessari per affrontare questi punti, la nostra prima comprensione delle proprietà riassemblaggio di isomin indica chiaramente la sua capacità di assemblare in filamenti. L'analisi filogenetica Quando isomin viene confrontato con il citoplasmatica IF sequenze disponibili in banca dati da altri phyla protostome, sembra a raggrupparsi con quelli nematode SE proteine che formano la IFC, IFD e corsi IFP (Figura 5). Sorprendentemente, il C. elegans IF proteine che si raggruppano con isomin sono tutti i componenti del intestinale web apicale terminale [17] e, come isomin, proteine IFC-1 e IFC-2 sono caratterizzati da un dominio coda più corta per la mancanza del segmento lamin-omologia che si verifica nella coda di tutti gli altri FI citoplasmatici protostome [6. 20]. analisi Distanza di isomin e protostome citoplasmatici proteine dei filamenti intermedi (IF). La ricostruzione dell'albero filogenetico è stata effettuata utilizzando il metodo vicino di casa-giunzione del pacchetto software PHYLIP. numeri di accesso GenBank, di cui al trmbl (TR) e Swiss-Prot (sp) banca dati, rispettivamente, sono seguiti da nomi di specie. Diverso phyla sono rappresentati da colori diversi. Nota: molluschi SE proteine si raggruppano in due gruppi, corrispondenti alle neuronale neuronale e non IF proteine. Solo citoplasmatica completa SE sequenze da protostome specie sono stati inclusi in questa analisi. Discussione Isomin è un vero e proprio ma peculiare proteina filamenti intermedi Tutti i membri della famiglia di proteine se la quota di proprietà biochimiche tipiche, la stessa organizzazione molecolare, aspetti peculiari della sequenza e la capacità di rimontare spontaneamente in vitro. senza la necessità di cofattori. I nostri risultati indicano che isomin possiede tutte le caratteristiche distintive IF. Innanzitutto, esso forma filamenti del citoscheletro che fanno parte della frazione resistente ai detergenti della cellula. In secondo luogo, essa segue l'architettura molecolare consenso tripartito basato su un dominio coiled coil centrale affiancato da estensioni terminali non elicoidali. In terzo luogo, possiede tutte le sequenze di firma che caratterizzano SE proteine: l'avvio elica e motivi di terminazione e la discontinuità conservata nella fase heptade in bobina 2. In quarto luogo, è in grado di auto-assemblarsi spontaneamente in filamenti in vitro. Così, le prove accumulate stabilisce chiaramente isomin come un nuovo membro della famiglia di proteine IF. Tuttavia, alcuni aspetti molto particolari si verificano nel primo segmento coiled coil della molecola isomin, rendendo questa proteina un membro molto unica della famiglia IF. Questa parte della molecola sembra discostarsi dal organizzazione del consenso della bobina 1a sottodominio. In isomin, questa regione mantiene la capacità di formare una struttura coiled coil solo sulla sua parte aminoterminale, che comprende il motivo iniziazione elica, e solo la presenza di questa sequenza conservata indica chiaramente che è legato alla bobina 1a di altre proteine IF. Così, una forte deriva sequenza è influenzato bobina 1a in isomin che appare, tuttavia, essere ancora compatibile con il processo di assemblaggio filamento. È interessante notare che la glicina e la sequenza ricca di serina seguente segmento coiled coil residua sia previsto di possedere una elevata flessibilità. Questa è una caratteristica strutturale che, nella maggior parte se proteine, caratterizza il distanziale L1 e che è cruciale per il corretto assemblaggio IF [4]. Pertanto, il verificarsi del motivo elica apertura seguita da una regione flessibile può ancora fornire la molecola isomin con le caratteristiche strutturali essenziali necessari per il montaggio del filamento. E 'anche interessante notare che, a SE proteine, bobina 1a è pensato di possedere proprietà distinte dagli altri sottodomini asta [25]. La possibilità che si potrebbe formare una struttura dinamica in grado di passare tra due filamento avvolto a bobina e una conformazione aperta costituito da due filamenti alfa-elica separati è stato proposto per vimentina vertebrato [26]. È stato anche suggerito che la capacità della bobina 1a a subire un riarrangiamento strutturale potrebbe essere importante durante la fase di allungamento del vimentina IF assemblaggio che avviene dalla ricottura longitudinale breve, ma già a tutta larghezza, filamenti unità di lunghezza (ULFs). L'assemblaggio di lunga asta invertebrati FI citoplasmatici segue un percorso diverso, che non implica la formazione di ULFs [27]. Piuttosto, tetrameri temprare longitudinalmente per formare lunghe protofilamenti che poi associano lateralmente a cedere il filamento maturo; questo processo è essenzialmente mediato dall'associazione antiparallelo della bobina 2 domini [27]. È possibile che questa via di IF assemblaggio è più compatibile con le deviazioni dalla struttura consenso che si sono verificati in bobina isomin 1a. Isomin presenta altre caratteristiche insolite oltre la divergenza sorprendente osservata nella regione della bobina 1 bis. Innanzitutto, possiede domini finali molto brevi: si è tentati di mettere in relazione la notevole riduzione della regione della testa - che è lungo solo 13 residui - alla divergenza della parte aminoterminale del rod dominio discusso sopra. In secondo luogo, il dominio coda è caratterizzato sia da una composizione aminoacidica insolito e l'assenza del cosiddetto dominio di lamin-omologia, che è una caratteristica comune a tutti protostome IF proteine, con pochissime eccezioni (vedi sotto). In terzo luogo, la discontinuità nella ripetizione heptad, che si osserva in tutti IF proteine in una posizione conservata della bobina 2, consiste nel isomin l'inserimento di due anziché quattro posizioni. Quarto, bobina 1b e bobina 2 sottodomini sono caratterizzati da proprietà fondamentali globali che è una caratteristica del tutto insolito tra IF domini asta che mostrano più comunemente caratteristiche di carica acide. Così isomin, mentre mostra la comune se caratteristiche molecolari, presenta una notevole divergenza dalla struttura di consenso IF. considerazioni evolutivi Isomin è il primo filamento intermedio citoplasmatica che, finora, è stato trovato per essere espresso in una specie di artropodi. Finora, artropodi sono stati pensati non per esprimere filamenti intermedi citoplasmatici sulla base sia microscopia elettronica e clonazione molecolare [6. 9. 10]. Tuttavia, questi studi di cui un numero limitato di specie. I. maculatus appartiene ad collemboli, un gruppo di esapodi basali che è stata recentemente posizionata vicino alla ramificazione dell'albero filogenetico artropodi, tra pancrustacea [28]. Così, per quanto riguarda le altre specie analizzate, collemboli potrebbero essere più probabilità di avere caratteri non distribuiti, che si sono verificati nel antenato comune, ma che sono stati successivamente persa durante l'evoluzione artropodi. Sia l'organizzazione della matrice citoscheletrica assembla in vivo e alcuni dei suoi aspetti molecolari trattasi in isomin ad un gruppo di IF proteine che vengono espresse in epitelio intestinale di nematodi. Il web terminale filamentosa trovato in I. maculatus è ultrastrutturale molto simile a quello descritto in alcuni nematodi (confrontare i nostri risultati con la figura 2 in [16]). In particolare, il verificarsi di una serie così particolare di FI nella regione sub-microvillar dell'epitelio intestinale non ha, finora, stato rilevato in qualsiasi altro gruppo di invertebrati, anche se la maggior parte delle phyla sono suscettibili di esprimere IF proteine nel loro epiteli interno [9 ]. Conclusioni metodi J Mol Biol. J Mol Biol. Diritto d'autore
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